王鑫英

1839年,一个名叫Robert Christison的苏格兰医生在他的著作中写道:“在肾病晚期,血液中的血红蛋白比例不可避免地大幅减少。”[1]这是人类历史上最早的关于慢性肾病所导致的贫血,即肾性贫血的文字记载。然而,直到150年之后,也就是1989年,肾性贫血患者才迎来了“大救星”——重组人促红细胞生成素(rHuEPO)促红细胞生成素(erythropoietin , EPO),又称促红素,单从名字上就可以看出,它是促进红细胞生成的。

在rHuEPO问世之前,肾性贫血患者还只能通过输血治疗来缓解贫血症状,而输血不可避免地存在风险,比如传染病、溶血性输血反应等等[2]。

那么,rHuEPO背后又有哪些故事呢?

这还得从一群可怜的兔子说起。

可怜的兔子

1906年,法国医生Paul Carnot和他的同事,做了一个非常清奇的实验:首先他们给兔子放了30ml左右的血,这算是人工模拟贫血状态吧。第二天他们再接着给兔子放血,然后等这些兔血凝集之后,分离出血清来。接着把9ml左右的血清注射给健康的兔子[3]。结果呢,他们发现,在输注了血清之后的一两天内,健康兔子的红细胞浓度就提高了20-40%。所以,Carnot就认为血清中含有造血因子。为此,Carnot还给它起了个法文名字叫hémopoiétine。虽然心疼被放血的兔子吧,但真的要给Carnot点赞。因为,正是他打开了后人寻找造血因子的大门

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插画:奇点插画师王爽

然而,寻找造血因子的过程并非轻而易举。好多科学家因为重复不出来Carnot的实验结果,甚至一度怀疑造血因子的存在。

又过了40多年,也就是1948年,芬兰科学家Eva Bonsdorff 和 Eeva Jalavisto把充血性心力衰竭患者的3ml血清输注给正常的兔子,结果发现兔子的红细胞略有升高[4]。

这样的实验结果让他们坚信人体中也存在刺激红细胞生成的造血因子,并正式把它命名为Erythropoietin即促红细胞生成素(EPO)

不过,他们还是不能证实EPO的存在。

好在没过几年,出生于丹麦的美国科学家Allan Erslev就首次证明了EPO的存在[5]。

他的这个重大发现同样是在兔子身上发现的。此时,是否应该给可爱的小兔子一点掌声呢?

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插画:奇点插画师王爽

值得一提的是,Erslev在他的论文[5]中做了一个大胆的预测:“分离纯化这种造血因子将会让其成为有用的药物可以用来治疗与红细胞生成障碍有关的疾病,比如慢性感染和慢性肾病。”

不得不说,Erslev真是个伟大的预言家!因为,几十年以后,人们确实是这样做的。

而EPO能走上临床用于肾性贫血的治疗,绝对离不开一位坚持不懈的美国生物化学家。

一位生物化学家的数十年奋斗史
这个生物化学家,名叫Eugene Goldwasser。1922年,Goldwasser出生于纽约布鲁克林,父亲是个小服装厂的老板。本来一家人的生活也算过得不错,但无奈遇上了经济大萧条。所以,他们举家搬迁至堪萨斯城。在那里,Goldwasser的哥哥继续从事服装生意,而他则开始了学业。Goldwasser大概是那种学霸级的人物,在高中时就对科学非常感兴趣,还获得了芝加哥大学的奖学金,并在芝加哥大学完成了生物化学本科学习。

Eugene Goldwasser
Eugene Goldwasser

二战爆发后,Goldwasser被选入美国陆军,负责军方的炭疽计划。1946年,Goldwasser退役后,又回到了芝加哥大学,用4年的时间就读完了生物化学硕士博士。之后,他又去丹麦做了两年博士后[6]。

1952年,Goldwasser再次回到芝加哥大学,这一次他做起了生物化学讲师。3年之后,Goldwasser在他的实验室老板Leon Jacobson安排下,负责寻找EPO的产生部位。

Goldwasser一开始觉得这都不是事儿,半年时间肯定能搞定。结果呢,都怪当时太年轻啊!没想到,这个课题一做就是两年。

Leon O. Jacobson
Leon Jacobson

不过,Goldwasser与EPO的不解之缘也就此开始了

他们这个研究是怎么做的呢?说来也挺简单,一个字“”!

但是,这也是个繁琐的活儿。因为他们先后切除了大鼠的下垂体、甲状腺、肾上腺、生殖腺、胰腺、脾脏、小肠,然后再用氯化亚钴(它可以引起缺氧,促进机体产生更多的血细胞)刺激大鼠,看看大鼠在切除了上述器官腺体之后还能不能继续产生EPO[7]。结果却发现这些都不管用,EPO还是照样产生。

这可是愁坏了两位科学家呀!

某一天呢,两人把大鼠的双肾都给切除了。然后,神奇的一幕发生了:再怎么用氯化亚钴刺激,大鼠血液中的EPO水平就是不增高了

为了验证这个结果,他们又拿兔子来重复了一番实验,也得到了同样的结果。

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插画:奇点插画师王爽

也就是说,肾脏是EPO的产生部位

于是,1957年,Goldwasser与Jacobson等人一起将研究结果发表在了《自然》上[7]。

这一重大发现一开始还引来了许多人的质疑。因为,有些科学家发现肝脏也可以产生EPO;甚至,还有人认为肝脏才是EPO产生的主要部位,肾脏不过是负责产生没有活性的EPO前体。

不过,这些质疑最终都被消除了。因为科学家们发现,在没有肾外基质或前体的存在下,分离的灌注肾也可以合成EPO。

现在科学家们已经知道,肾脏是产生EPO的主要器官但并不是唯一器官而肝脏则是除了肾脏之外产生EPO的主要器官并且是胎儿时期EPO合成的主要器官[8]。

Erythropoietin-EPO
EPO促进红细胞生成的示意图

解决了EPO产生部位后,随之而来的问题就是怎么得到纯净的EPO。这就涉及EPO的纯化了。

物质纯化这种事儿,生物化学家们最擅长了。所以,EPO的纯化还是离不开Goldwasser这个伟大的生物化学家。

一开始,Goldwasser来来回回奔走在芝加哥大学和郊外的一家屠宰场之间,为的是从绵羊血液中纯化EPO。然而,到了1971年,Goldwasser和他的同事用了大概473升(125加仑)绵羊血浆才纯化得到了6μg的EPO[9] ……

很心酸吧?

终于,在1973年,事情有了转机!

这时,一个名叫Takaji Miyake日本医生到芝加哥大学交流学习,他发现再生障碍性贫血患者的尿液中就含有EPO,而他正在收集患者的尿液,所以,他想跟Goldwasser合作,提纯人的EPO[6]。

这简直是天大的好事儿呀!

Goldwasser立即答应了。于是两人分头行动,Goldwasser负责去联邦机构申请资金,Miyake则负责收集尿液,他总共收集了2550L尿液[10]。

在1975年圣诞节的那天, Miyake带着浓缩的尿液来到了芝加哥。接下来,就是 Goldwasser大显神通的时刻了。

Goldwasser带领团队,采用乙醇沉淀、离子交换层析、凝胶过滤、吸附层析等7个步骤,最终得到了8mg人的 EPO。

虽然这8mg看起来是挺少的,但比起Goldwasser曾经获得的6μg羊的EPO来说,实在算是大获成功了。

1977年,Goldwasser等人将研究结果发表在了《生物化学杂志》上[10]。

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2005年,Goldwasser(中)获得了泰国玛希顿亲王奖

从1957年到1977年,20年过去了,Goldwasser本来想着自己这算是功成名就了吧。于是,在同事的催促下,他向校方提交了专利申请表结果负责专利申请的人没理他!Goldwasser后来也没有继续跟进,专利这事儿也就算了[6]。

不过呢,这个时候,一家名为Applied Molecular Genetics的小型的生物技术公司主动找到了Goldwasser,希望跟他合作,聘请他为技术顾问。这个公司,看起来是不是很陌生?后来人家改了名字叫Amgen,安进。(论名字的重要性)

Goldwasser很快同意了。Amgen的一位台胞科学家,Fu-Kuen Lin带领团队,利用Goldwasser提纯的EPO,经过氨基酸序列分析后设计了两种探针,克隆到了EPO的基因,并且把它转入到了中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells , CHO细胞)中,然后借助CHO细胞生产出了重组人促红细胞生成素(rHuEPO)[11]。而且,Fu-Kuen Lin还证明rHuEPO在体内体外试验中都有活性。

林福坤
Fu-Kuen Lin

这就意味着体外生产EPO成功啦!

1985年,Fu-Kuen Lin与Goldwasser等人将研究结果发表在了《美国科学院院报》上[11]。

后来的研究表明,rHuEPO与从尿液中提纯的人EPO没有什么差别,它们都是糖蛋白其蛋白部分的氨基酸序列是相同的都是由165个氨基酸组成的分子量大小18.4kDa的多肽都不含有末尾的精氨酸[12,13]。

而且,在尿毒症且贫血的绵羊和大鼠中,输注rHuEPO可以增加红细胞量。这就意味着肾病患者输注EPO应该也会有好的治疗效果。

既然动物实验没有问题,那就上临床吧。

1986年rHuEPO临床试验正式开展。25名晚期肾病患者经血液透析后,每周三次静脉输注rHuEPO,输注的比例为15~500U/kg[14]。

按照500U/kg比例输注rHuEPO的患者,血细胞比容在3周内就升高了10%、铁动力学指标增高到基线值的3到4倍。18名接受有效剂量rHuEPO的患者中,有12名患者不再需要输血治疗11名患者的血细胞比容增高了35%以上[14]。

另外,rHuEPO在安全性方面表现也很好,在临床试验中没有观察到器官功能障碍等毒性作用。相关的研究结果刊登在1987年的《新英格兰医学杂志》上[14]。

可以说,rHuEPO治疗肾性贫血的临床试验成功了

很快,1989年首个rHuEPO药物Epogen被美国FDA批准上市用于治疗肾性贫血。rHuEPO一经上市就给安进带来了数亿销售额。

而助力安进的Goldwasser则继续在芝加哥大学搞研究,他一直工作到80岁才离开自己热爱的实验室。

2010年,88岁的Goldwasser因前列腺癌相关的肾功能衰竭去世了。

逐鹿中原的仿制药大战
Epogen上市后,很多肾性贫血患者得到了极好的治疗,输血治疗不再是他们的唯一选择。

1992年,我国也引进了Epogen。然而,这个原研药的价格还是让许多患者望而却步。

即便如此,rHuEPO的市场需求仍然是非常大的。单从一组流行病学数据中,就能窥见一斑吧:

肾性贫血是慢性肾病的常见并发症而慢性肾病的患病率在美国是13.0%[15],在挪威是10.2%[16],在中国是10.8%[17]。

所以,面对巨大的市场需求,估计任何一家有能力的制药企业都不想错过这块大蛋糕。

随着rHuEPO原研药专利的到期,世界各地的制药企业纷纷加入到仿制药市场的角逐中。罗氏、强生等西方制药巨头自然不会错过这场好戏,亚洲的制药企业也不甘人后。

在2009年的一项研究[18]中,研究者比较了12种由亚洲药企生产的rHuEPO仿制药和原研药Epogen的质量。结果发现,一款名为益比奥(Epiao)的rHuEPO仿制药质量稳定、糖基化程度高、理化性质最为接近Epogen。

不同厂家 rHuEPO 的等电聚焦电泳WB结果

益比奥由三生制药研发生产作为首批国产rHuEPO药物在1998年被CFDA批准上市。以其明显的价格优势和良好的疗效,逐渐占据了国内rHuEPO的绝对领导地位。

不得不说,在rHuEPO的研发生产中,国内的制药企业做的还真是可圈可点。

EPO的其他用途

除了治疗肾性贫血之外,EPO还可用于治疗癌症化疗相关的贫血。约翰霍普金斯癌症中心的研究发现,有些实体瘤患者的EPO水平很低,这可能是造成其贫血的原因,因此有必要采用EPO治疗癌症相关的贫血[19]。

EPO还可以最大限度地减少接受外科手术患者的输血。研究表明,在不能进行自体输血的患者中,在手术前进行3-4周低剂量EPO治疗可以让输血频率降低50%[20]。在动物实验中,研究者发现EPO具有神经保护作用[21],这也让EPO被用到了减少创伤性脑损伤(TBI)患者(比如各种车祸导致的脑部损伤)二次脑损伤的治疗上。

在一项涉及29个医疗中心的双盲随机对照试验中[22],相比于脑损伤24小时内接受生理盐水皮下注射的TBI患者,接受EPO皮下注射的TBI患者6个月时的死亡率更低。不过,研究者也表示,EPO的神经保护作用还需要更多的研究来证实。

此外,EPO也被用于治疗糖尿病患者的慢性伤口愈合、促进巨噬细胞的抗炎活性等等的研究[23]。

最后,引用一位德国教授的文章题目[2]结束今天的话题吧:跨越一个世纪的研究,EPO比以往更年轻!

参考资料:

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[23] Spivak J L. Erythropoietin use and abuse[M]//Hypoxia. Springer, Boston, MA, 2001: 207-224.

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