奇点

从2016年FDA批准首个基于EGFR基因突变的液体活检产品,到今年8月bTMB被证实可以预测免疫治疗的效果,液体活检已在肿瘤治疗领域大放异彩。

不幸的是,血液中的肿瘤循环DNA分子含量通常远远低于血液中非癌症相关DNA的片段,这使得检测它们非常困难,特别是在癌症的早期阶段

今天,英国剑桥大学科学家Nitzan Rosenfeld带领的团队,终于为液体活检打开了封印。他们发现了血液中循环肿瘤DNA和非肿瘤DNA片段的长度分布特征。找到了一种更灵敏的血液中肿瘤DNA检测方法。

前排中间为Nitzan Rosenfeld博士
前排中间为Nitzan Rosenfeld博士

研究者们在体外富集血浆中特定片段长度的游离DNA(cfDNA),然后测序,发现用测序结果区分肿瘤血液样本和健康血液样本时,曲线下面积超过0.99,而未富集的普通cfDNA检测只有不到0.8。此外,这种富集的方法可以使液体活检在更早期就能检测到癌症。这项研究发表在最新一期的著名学术期刊Science Translational Medicine 上[1]。

血浆中存在着很多游离的DNA(cfDNA),包括肿瘤来源的(ctDNA),以及非肿瘤来源的非肿瘤来源的DNA占了cfDNA的绝大部分,使得ctDNA的丰度很低[2]。以往的研究发现,只有当ctDNA在cfDNA中的丰度在10%或以上时,才能得到准确的肿瘤信息[3]。但是,除了某些晚期的肿瘤会释放大量ctDNA外,大多数肿瘤患者的ctDNA的丰度达不到这个标准[4]。

目前,主要是通过加大测序深度来提高ctDNA检测的灵敏度和准确率,但是加大测序深度可能会带来假阳性的结果,因为非肿瘤来源的DNA中也可能带有各种肿瘤相关的突变[5]。这些问题一直限制着液体活检的应用。

5不过,科学家的另一个发现却可能解决这个问题。之前有研究表明,不同细胞释放到血液中的cfDNA的长度会有所不同,例如,很多cfDNA的长度都是167bp(与一个核小体的DNA长度类似),这可能与细胞凋亡过程中半胱天冬酶依赖的DNA裂解相关[6]。

婴儿的cfDNA就明显比母亲的cfDNA片段短,这个特点被运用与产前诊断[7]。这些研究说明不同细胞来源的cfDNA在长度上会呈现独特的模式,可能可以作为区分cfDNA来源的信号。

这种cfDNA片段长度的差异很可能就存在于肿瘤细胞与非肿瘤细胞之中。这是一个绝妙的假设,如果这个假设成立,就可能解决肿瘤液体活检面临的困境。

不过,之前少数几个在此方面的研究却得出了相互冲突的结果,使得这方面的研究裹足不前。他们的问题主要在于不了解造成这种生物学差异的原因[8]。也即,不知道肿瘤细胞的DNA长度为什么会不同,使DNA片段的长度特征信号无法准确地代替肿瘤cfDNA

Nitzan Rosenfeld博士接过了这个研究的大旗。他们猜测之前研究者失败的原因,可能是得到的ctDNA片段的长度特征信号不够灵敏

于是,Rosenfeld博士带领的研究者们设计新的方案进行了研究。他们从200个癌症病人中收集了344份血浆样本(包括18种不同类型的癌症),然后取了65个健康人的血浆样本作为对照。提取这些血浆样本中的cfDNA后,分析发现健康人与癌症患者的cfDNA在90 – 150 bp、180 – 220 bp和250 – 320 bp之间的分布都有所不同。

带肿瘤突变的片段在一个区间富集
带肿瘤突变的片段在一个区间富集

当他们将这些cfDNA测序后发现了令人惊讶的结果,带有癌症突变的ctDNA片段普遍比核小体DNA片段(167bp)短20-40bp,在90-150bp区间富集,还有些在250-320bp之间富集(这可能是肿瘤细胞的双核小体片段)。

以上结果可能预示着ctDNA在90-150bp区间的丰度可能会很高。研究者们在一种硅芯片上将cfDNA在按片段长度进行分离,通过测序发现在90-150bp区间中,ctDNA的丰度明显提高。这说明可以通过富集短片段的方法提高ctDNA的丰度,进而能提高检测的灵敏度和准确性。

于是,研究者们先用这种片段选择性测序的方法检测癌症病人的肿瘤进展,发现比CT成像提前了60天检测了肿瘤进展,而比未经过片段选择性的液体活检提前了89天。片段选择性测序显示了无与伦比的优势!

新方法的优势还不止于此,研究人员取了一个队列研究中48份肿瘤患者的血浆样品,分别通过cfDNA片段选择性测序和普通cfDNA测序,与已知结果相比,两者的准确率分别是82%和50%。片段选择性测序对准确率的提升幅度异常明显。

但是,科学家对这个结果还不是很满意,觉得它还有提升的空间。因为其他长度的片段上也存在肿瘤突变,而只取90-150bp的片段会丢失一些信息。这种粗犷划分显然不能代表现代科学的水平。

接着,研究者们将各个长度区间的片段,包括P(20 to 150),P(100 to 150),P(160 to 180), P(180 to 220),以及 P(250 to 320),都进行了分析,结合已知的突变位点,通过机器学习算法去寻找更加精细的规律,得到了一个人工智能模型。用这个模型在区分肿瘤血液样本和健康血液样本时,曲线下面积达到0.994,相当令人震撼

片段特异性测序显示了完美的准确率
片段特异性测序显示了完美的准确率
当然,作者表示他们的方法还有一定局限性,那就是他们在体外对不同片段长度的DNA进行分离的方法,会造成一定偏差。可能不能准确反应小于100bp和大于300bp长度的ctDNA。

尽管如此,从已达到的效果来看,这个通过片段特异富集进行液体活检的方法,可以更早更灵敏地检测肿瘤,这对于肿瘤的治疗有重要意义!

本文第一作者Moulier说道,理论上这项新技术可以用于检测所有类型的肿瘤。并且,这种技术对很多实验室来说都很简单,这意味着在不久的将来,它就能对公众开放[9]。

参考资料:

[1]http://stm.sciencemag.org/content/10/466/eaat4921.full

[2] G. Siravegna, S. Marsoni, S. Siena, A.Bardelli, Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nat. Rev. Clin.Oncol. 14, 531–548 (2017).

[3] M. Murtaza, S.-J. Dawson, D. W. Y.Tsui, D. Gale, T. Forshew, A. M. Piskorz, C. Parkinson, S.-F. Chin, Z. Kingsbury, A. S. C. Wong, F.Marass, S. Humphray, J. Hadfield, D. Bentley, T. M. Chin, J. D. Brenton, C. Caldas, N.Rosenfeld, Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencingof plasma DNA. Nature 497, 108–112 (2013).

[4] C. Bettegowda, M. Sausen, R. J. Leary,I. Kinde, et al. A., Detection of circulating tumor DNA in early- andlate-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, 224ra24 (2014)

[5] I. S. Haque, O. Elemento, Challenges inusing ctDNA to achieve early detection of cancer.bioRxiv 237578 [preprint]. 21 December2017.

[6] S. Jahr, H. Hentze, S. Englisch, D.Hardt, F. O. Fackelmayer, R.-D. Hesch, R. Knippers, DNA fragments in the blood plasma of cancerpatients: Quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells.Cancer Res. 61, 1659–1665 (2001)

[7] Y. M. D. Lo, K. C. A. Chan, H. Sun, E.Z. Chen, P. Jiang, F. M. F. Lun, Y. W. Zheng, T. Y. Leung, T. K. Lau, C. R. Cantor, R. W. K. Chiu,Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profileof the fetus. Sci. Transl. Med. 2, 61ra91 (2010).

[8] H. R. Underhill, J. O. Kitzman, S.Hellwig, N. C. Welker, R. Daza, D. N. Baker, K. M. Gligorich, R. C. Rostomily, M. P. Bronner, J.Shendure, Fragment length of circulating tumor DNA. PLOS Genet. 12, e1006162 (2016).

[9]https://www.newscientist.com/article/2184604-blood-test-can-spot-dna-from-eight-different-types-of-cancer/

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